近日， 南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院鄧仲良副教授團(tuán)隊(duì)與南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院何軍主任技師在 CRISPR/Cas分子診斷領(lǐng)域取得重要進(jìn)展。相關(guān)研究成果發(fā)表在生物電子傳感領(lǐng)域 著名 期刊 Biosensors and Bioelectronics （ 《 生物傳感器和生物電子學(xué) 》 ） ，該期刊為傳感器領(lǐng)域頂尖期刊。論文題為 "Efficient, specific and direct detection of double-stranded DNA targets using Cas12f1 nucleases and engineered guide RNAs （利用 Cas12f 1 核酸酶和工程化向?qū)?/span> RNA 高效、特異和直接檢測雙鏈 DNA 靶標(biāo)） "。鄧仲良副教授為通訊作者，何軍主任技師和研究生胡茜盼為 共同 第一作者，南華大學(xué)為第一完成單位。

CRISPR/Cas是廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中 的 一種自身免疫系統(tǒng)， 廣泛用于基因編輯和分子診斷，并已成功用于地中海貧血等遺傳性疾病的治療，此外還可用于傳染病診斷、食品安全、環(huán)境監(jiān)測和耐藥突變及腫瘤單堿基變異等檢測。 CRISPR / Cas技術(shù)能簡單、快速、靈敏和特異檢測病原體，是目前研究的熱點(diǎn)和前沿技術(shù)。 2018 年被《 Science 》譽(yù)為下一代分子診斷技術(shù)。近年來，發(fā)現(xiàn) Ⅱ類 CRISPR / Cas12和 CRISPR / Cas13系統(tǒng)具有附帶切割活性（ collateral cleavage ），通過向?qū)?/span> RNA(single guide RNA ， sgRNA) 特異識別和激活帶 PAM （ Protospacer Adjacent Motif ， PAM ）的靶序列，從而激活 Cas 酶的非特異切割單鏈熒光標(biāo)記探針活性，但為了達(dá)到臨床檢測所需的靈敏度，需結(jié)合等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，才能簡單 、 快速、靈敏和特異檢測病原體 DNA或 RNA ，但區(qū)分單堿基變異（ Single nucleotide variation ， SNV ）能力不足，需要發(fā)展一種靈敏度相當(dāng) 、 特異性更好的 CRISPR分子診斷工具。

2018年，課題組發(fā)現(xiàn)一種新的 CRISPR/Cas14a1 系統(tǒng)（也稱 Un1Cas12f1 ），蛋白分子量小，且對單鏈 DNA 的單堿基分辨率較 Cas12a 更好，能用于單鏈 DNA 和 RNA 檢測，但制備單鏈 DNA 和體外轉(zhuǎn)錄操作復(fù)雜，限制了在臨床進(jìn)一步應(yīng) 用 。為克服上述挑戰(zhàn)，課題組篩選 到 最佳的 CRISPR/Cas12f1_ge4.1工程化系統(tǒng)，并結(jié)合 RPA （ Recombinase Polymerase Amplification ）等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，建立一種新型 CRISPR 熒光傳感平臺 - PDTCTR (PAM-dependent dsDNA Target-activated Cas12f1 Trans Reporter) ， 能在 50分鐘內(nèi)快速和靈敏檢測肺炎支原體和乙肝病毒，最低檢出限為 10 copies/μL，較野生型系統(tǒng)靈敏度提高 100 倍 。 此外新型的 PDTCTR系統(tǒng)具有良好的單堿基區(qū)分能力， 單堿基分辨的特異性優(yōu)于 Cas12a ， 能精準(zhǔn)鑒別非小細(xì)胞肺癌 EGFR (L858R)點(diǎn)突變 ， 通過對 臨床樣品進(jìn)行性能評估，該系統(tǒng) 與 定量 PCR 相 比有較高敏感度和特異度，分別為 93%–100%和 100% ，凸顯其在傳染病和癌癥相關(guān) SNVs 診斷方面具有較大應(yīng)用潛力。 總之， PDTCTR系統(tǒng)為分子診斷提供了快速、高效和特異的檢測工具，為傳染病病原體和腫瘤癌基因相關(guān)的 SNV 精準(zhǔn)檢測提供新的檢測手段和思路。

本研究工作得到了湖南自然科學(xué)基金、湖南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目、湖南省衛(wèi)健委重點(diǎn)項(xiàng)目支持，此外這項(xiàng)原創(chuàng)性成果獲得國家發(fā)明專利快速授權(quán)，并獲得第一屆湖南省研究生醫(yī)學(xué)創(chuàng)新大賽三等獎和 2022年衡陽醫(yī)學(xué)院學(xué)術(shù)墻報(bào)日十佳學(xué)術(shù)新人獎。該項(xiàng)成果的順利完成，得益 于 附屬南華醫(yī)院何軍主任技師的緊密合作，為該項(xiàng)研究提供了臨床樣品、資金 和 場地；得益 于 基礎(chǔ)和臨床醫(yī)院的創(chuàng)新人才模式 （校內(nèi)和校外導(dǎo)師聯(lián)合培養(yǎng)） ，培養(yǎng)了多名優(yōu)秀研究生。 （鄧仲良 何軍）

責(zé)編：張芷瑜

一審：張芷瑜

二審：張馬良

三審：熊佳斌

來源：新湖南客戶端